본 키트는 인후면봉, 비인두면봉, 기관지폐포세척액, 가래 등을 이용하여 신종 코로나바이러스(2019-nCoV)를 정성적으로 검출하기 위한 키트입니다. 임상 진단 및 치료에 대한 증거. 환자의 임상 증상 및 기타 실험실 테스트와 함께 상태에 대한 포괄적인 분석이 권장됩니다.
이 키트는 원스텝 RT-PCR 기술을 기반으로 합니다.실제로 2019년 신종 코로나바이러스(2019-nCoV) ORF1ab와 N 유전자가 증폭 대상 부위로 선정됐다.특정 프라이머 및 형광 프로브(N 유전자 프로브는 FAM으로 표시되고 ORF1ab 프로브는 HEX로 표시됨)는 샘플에서 2019 신종 코로나바이러스 RNA를 검출하도록 설계되었습니다.이 키트에는 샘플 수집, RNA 및 PCR 증폭 과정을 모니터링하여 위음성 결과를 줄이기 위한 내인성 내부 제어 감지 시스템(CY5로 표시된 내부 제어 유전자 프로브)도 포함되어 있습니다.
구성품 | 용량(48T/키트) |
RT-PCR 반응 솔루션 | 96µl |
nCOV 프라이머 TaqMan 프로브 혼합물(ORF1ab,N Gene,RnaseP Gene) | 864µl |
네거티브 컨트롤 | 1500µl |
nCOV 양성 대조군(l ORF1ab N Gene) | 1500µl |
자체 시약: RNA 추출 또는 정제 시약.음성/양성 대조군: 양성 대조군은 표적 단편을 포함하는 RNA이고 음성 대조군은 핵산이 없는 물입니다.사용하는 동안 추출에 참여해야 하며 전염성이 있는 것으로 간주해야 합니다.관련 규정에 따라 취급 및 폐기해야 합니다.
내부 참조 유전자는 인간 RnaseP 유전자입니다.
-20±5℃, 5회 이상 반복 동결 및 해동을 피하고 6개월 동안 유효합니다.
FAM / HEX / CY5 및 기타 다중 채널 형광 PCR 장비 포함.
1. 적용 가능한 검체 유형: 인후 면봉, 비인두 면봉, 기관지폐포 세척액, 가래.
2.검체채취(무균법)
인두 면봉: 두 개의 면봉으로 편도선과 후인두벽을 동시에 닦은 다음 면봉 헤드를 샘플링 용액이 들어 있는 시험관에 담급니다.
가래: 환자가 깊은 기침을 한 후, 기침 가래를 샘플링 용액이 들어 있는 스크류 캡 테스트 튜브에 수집합니다.기관지 폐포 세척액 : 의료 전문가의 샘플링.3. 시료 보관 및 운송
바이러스 분리 및 RNA 검사를 위한 검체는 가능한 한 빨리 검사해야 합니다.24시간 이내 검출이 가능한 검체는 4℃에서 보관할 수 있습니다.24시간 이내에 감지할 수 없는 것
시간 -70℃ 이하에서 보관해야 함(-70℃ 보관 조건이 없을 경우
-20℃냉장고에 임시 보관).검체는 운송 중에 반복적인 동결과 해동을 피해야 합니다.검체는 수집 후 가능한 빨리 실험실로 보내야 합니다.샘플을 장거리 운송해야 하는 경우 드라이아이스 보관을 권장합니다.
1 시료 처리 및 RNA 추출(시료 처리 영역)
RNA 추출을 위해 200μl의 액체 샘플을 채취하는 것이 좋습니다.관련 추출 단계는 상용 RNA 추출 키트의 지침을 참조하십시오.부정과 부정 모두
이 키트의 컨트롤이 추출에 관여했습니다.
2 PCR 시약 준비(시약 준비 영역)
2.1 키트에서 모든 구성 요소를 제거하고 실온에서 해동하고 혼합합니다.사용하기 전에 몇 초 동안 8,000rpm에서 원심분리기;필요한 시약의 양을 계산하고 다음 표와 같이 반응 시스템을 준비합니다.
구성품 | N 서빙(25µl 시스템) |
nCOV 프라이머 TaqMan 프로브 혼합물 | 18µl × N |
RT-PCR 반응 솔루션 | 2µl × N |
*N = 테스트한 샘플 수 + 1(음성 대조군) + 1(nCOV양성 대조군) |
2.2 각 성분을 충분히 혼합한 후 짧은 시간 동안 원심분리하여 튜브 벽에 있는 모든 액체가 튜브 바닥으로 떨어지도록 한 다음 20 µl 증폭 시스템을 PCR 튜브에 분주합니다.
3 샘플링(검체 준비 영역)
추출 후 음성 및 양성 대조군 5μl를 추가합니다.검사할 샘플의 RNA를 PCR 반응 튜브에 넣습니다.
증폭 감지 영역으로 옮기기 전에 튜브를 단단히 닫고 몇 초 동안 8,000rpm에서 원심분리합니다.
4 PCR 증폭(검출 영역 증폭)
4.1 기기의 샘플 셀에 반응 튜브를 놓고 다음과 같이 매개변수를 설정합니다.
단계 | 주기 숫자 | 온도(°C) | 시간 | 수집대지 |
뒤집다전사 | 1 | 42 | 10 분 | - |
사전 변성n | 1 | 95 | 1 분 | - |
주기 | 45 | 95 | 15초 | - |
60 | 30대 | 데이터 수집 |
기기 감지 채널 선택: 형광 신호에 대한 FAM, HEX, CY5 채널을 선택합니다.참조 형광 NONE의 경우 ROX를 선택하지 마십시오.
5 결과 분석 (설정은 각 기기의 실험 설명서 참조)
반응 후 결과를 저장합니다.분석 후 이미지에 따라 기준선의 시작값, 종료값, 임계값을 조정합니다. 5~20, 조정) 대수 그래프에서 창의 임계값에서 임계선은 대수 위상에 있고 음성 대조군의 증폭 곡선은 직선 또는 임계선 아래임).
6 Quauty 제어(시험에 절차 제어가 포함됨) 음성 제어: FAM, HEX, CY5 검출 채널에 대한 명확한 증폭 곡선 없음
COV 양성 대조군: FAM 및 HEX 검출 채널의 명백한 증폭 곡선, Ct 값≤32, 그러나 CY5 채널의 증폭 곡선 없음;
위의 요구 사항은 동일한 실험에서 동시에 충족되어야 합니다.그렇지 않으면 실험이 유효하지 않으며 반복해야 합니다.
7 결과 결정.
7.1 검사 시료의 FAM 및 HEX 채널에 증폭 곡선이 없거나 Ct 값>40이고 CY5 채널에 증폭 곡선이 있으면 2019 신종 코로나바이러스(2019-nCoV)가 없다고 판단할 수 있습니다. 샘플의 RNA;
.2 테스트 샘플이 FAM 및 HEX 채널에서 증폭 곡선이 뚜렷하고 Ct 값이 ≤40이면 샘플이 2019년 신종 코로나바이러스(2019-nCoV)에 대해 양성이라고 판단할 수 있습니다.
7.3 검사 시료가 FAM 또는 HEX의 한 채널에서만 증폭 곡선이 뚜렷하고 Ct 값이 40 이하이고 다른 채널에서 증폭 곡선이 없으면 결과를 다시 테스트해야 합니다.재검사 결과가 일치하는 경우 샘플은 새로운 테스트에 대해 양성으로 판단할 수 있습니다.
코로나바이러스 2019(2019-nCoV).재검사 결과가 음성이면 2019년 신종 코로나바이러스(2019-nCoV)에 대해 음성인 것으로 판단할 수 있다.
ROC 곡선 방법은 키트의 참조 CT 값을 결정하는 데 사용되며 내부 제어 참조 값은 40입니다.
1. 각 실험은 음성 및 양성 대조군에 대해 테스트해야 합니다.컨트롤이 품질 관리 요구 사항을 충족하는 경우에만 테스트 결과를 결정할 수 있습니다.
2. FAM 및 HEX 감지 채널이 양수인 경우 시스템 경쟁으로 인해 CY5 채널(내부 제어 채널)의 결과가 음수가 될 수 있습니다.
3. 내부 제어 결과가 음성일 때 테스트 튜브의 FAM 및 HEX 감지 채널도 음성이면 시스템이 비활성화되었거나 작동이 잘못되었음을 의미하며 테스트가 유효하지 않습니다.따라서 샘플을 다시 테스트해야 합니다.